1. 取材
组织块小于1立方毫米。
2. 前固定
2.5%戊二醛,磷酸缓冲液配制(0.1M,pH7.2-7.4)固定2小时以上。
3. 清洗
用0.1M磷酸缓冲液漂洗,3-4次,每次15分钟
4. 后固定
1%锇酸固定,磷酸缓冲液配制(0.1M,pH7.2-7.4),2-3小时,动物2小时,植物4小时。
5. 清洗
用0.1M磷酸缓冲液漂洗,3-4次,每次15分钟以上在4°C冰箱内进行
6. 梯度脱水
30%乙醇15-20分
50%乙醇15-20分
70%乙醇(可加醋酸铀过夜)15-20分
90%乙醇15-20分
95%乙醇15-20分
100%乙醇,两次15-20分
100%乙醇:100%丙酮(1:1)15-20分
100%丙酮(加分子筛或无水Na2SO4),2次,每次,15-20分
7. 树脂渗透
100%丙酮:Epon812=2:1,室温3-4小时
100%丙酮:Epon812=1:2,室温3-4小时
纯包埋剂,2次,每次室温3-4小时
8. 包埋
利用包埋模具包埋,如需定位,注意方向。
9. 固化
37°C烘箱内12小时
45°C烘箱内12小时
60°C烘箱内48小时
10. 超薄切片
超薄切片机切片,厚度50-70nm
11. 铅铀双染色
2%醋酸双氧铀染色10-30分钟
柠檬酸铅染色5-15分钟
12. 电镜观察